關(guān)節(jié)軟骨是關(guān)節(jié)中的彈性結(jié)締組織。軟骨損傷是非常普遍的，但是由于其低細(xì)胞性和無血管性質(zhì)，軟骨具有有限的自我修復(fù)能力。由于軟骨的損傷導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)功能障礙，導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)嚴(yán)重疼痛和殘疾，因此軟骨或關(guān)節(jié)重建仍然是相當(dāng)大的挑戰(zhàn)。在臨床實踐中關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)由全關(guān)節(jié)成形術(shù)使用金屬和合成的假體?，F(xiàn)有的關(guān)節(jié)假體不會與宿主關(guān)節(jié)組織重塑，并且可能因無菌性松動或感染而導(dǎo)致長期衰竭，只能通過關(guān)節(jié)的生物再生來解決。
使用間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）移植，然后刺激定向分化為軟骨細(xì)胞正在成為軟骨修復(fù)的首選。近日，南京醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院和上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院研究人員在《Science Advances》上發(fā)表了題為“3D bioprinting dual-factor releasing and gradient-structured constructs ready to implant for anisotropic cartilage regeneration”的研究論文，描述了三維（3D）生物打印雙因子釋放和梯度結(jié)構(gòu)構(gòu)造的各向異性軟骨再生。
載有雙因子的間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）負(fù)載的水凝膠用于各向異性軟骨形成的分化。3D生物打印各向異性軟骨構(gòu)造與賦予機(jī)械強(qiáng)度的物理梯度合成生物可降解聚合物一起，證明了整個層的完整性，表層的潤滑以及深層的營養(yǎng)供應(yīng)。在體外和體內(nèi)對軟骨組織的評估表明，組織的成熟和組織具有轉(zhuǎn)化前景。
3D生物打印以制造雙因子釋放和梯度結(jié)構(gòu)的軟骨構(gòu)建體
為了更好地模擬天然軟骨，研究人員結(jié)合了具有不同生長因子釋放的生化刺激（BCS）和具有較小孔徑的生物力學(xué)刺激（BMS），以誘導(dǎo)更好的軟骨形成，從而在創(chuàng)建了雙因子釋放和梯度結(jié)構(gòu)的軟骨構(gòu)造刺激（DS）組。在軟骨構(gòu)造中，通過聚乳酸-乙醇酸共聚物（PLGA）（50:50 PLA / PGA）微球用于在水凝膠中遞送TGFβ3和BMP4引入骨形態(tài)發(fā)生蛋白4（BMP4）和轉(zhuǎn)化生長因子β3（TGFβ3）的組合。
用于植入的3D生物打印梯度軟骨支架
對于兔軟骨構(gòu)建體，支架為4×4×4 mm；對于人軟骨構(gòu)建體，則為14×14×14 mm。將TGFβ3和BMP4微球分別混合在充滿細(xì)胞的水凝膠中，并使用不同的注射器將其印刷到PCL纖維之間的微通道中。為了化學(xué)模擬天然軟骨中的肥大層，研究人員在最深的層中使用了PLGA BMP4包裹的MSC負(fù)載水凝膠，其PCL纖維間距為750μm，而PLGA-TGFβ3用于軟骨構(gòu)造的其他三層。
雙重釋放因子納米顆粒對BMSCs體外存活和增殖的影響
在支架中檢查了細(xì)胞活力和增殖。印刷的載有細(xì)胞的水凝膠使細(xì)胞沿印刷路徑的縱向排列，形成具有細(xì)胞相互作用的網(wǎng)狀網(wǎng)絡(luò)。最終構(gòu)建物中的PCL支柱結(jié)構(gòu)進(jìn)一步穩(wěn)定了3D打印的BMSC組織，從而在充滿細(xì)胞的水凝膠中誘導(dǎo)了細(xì)胞排列模式的壓實現(xiàn)象。活/死細(xì)胞分析顯示，第0天的細(xì)胞活力≥95％，在第3天到第21天保持超過75％的活力。表明一步法3D生物打印的雙因子釋放和梯度結(jié)構(gòu)優(yōu)化的軟骨支架在打印過程中保留了細(xì)胞活力，并為BMSC的增殖，擴(kuò)散和濃縮提供了有利的微環(huán)境，以在體外分化為軟骨細(xì)胞。
時空釋放的rhTGFβ3和rhBMP4在3D生物打印的梯度結(jié)構(gòu)支架中體外誘導(dǎo)軟骨基質(zhì)形成
在支架的體內(nèi)應(yīng)用之前，研究人員確定了rhTGFβ3和rhBMP4的時空傳遞是否誘導(dǎo)層特異性BMSC分化成軟骨細(xì)胞并呈現(xiàn)出透明的關(guān)節(jié)和肥大的表型。
具有透明質(zhì)和肥大表型的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞首先是從兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外獲得的。透明質(zhì)軟骨細(xì)胞同時產(chǎn)生聚集蛋白聚糖和II型膠原，而肥大軟骨細(xì)胞同時產(chǎn)生I型膠原和X型膠原。
在培養(yǎng)物中連續(xù)施用rhTGFβ3 2周，然后再進(jìn)行rhTGFβ3 4周，誘導(dǎo)BMSCs分化為軟骨細(xì)胞，該軟骨細(xì)胞合成了聚集蛋白聚糖和II型膠原蛋白，表明是透明的關(guān)節(jié)軟骨樣細(xì)胞。。
此外，TGFβ3誘導(dǎo)的組織中的細(xì)胞是成纖維細(xì)胞，而BMP4誘導(dǎo)的細(xì)胞則更大，類似于先前在培養(yǎng)物中產(chǎn)生的肥大軟骨細(xì)胞。兩種處理均誘導(dǎo)BMSC分化并產(chǎn)生軟骨基質(zhì)，該基質(zhì)在濃縮的BMSC中對甲苯胺藍(lán)和阿爾辛藍(lán)染色呈陽性，表明富含蛋白聚糖，軟骨樣ECM。
雙因子釋放和梯度結(jié)構(gòu)支架在兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損模型體內(nèi)顯示出更好的軟骨修復(fù)效果
將兔用作動物模型以評估軟骨支架的膝蓋修復(fù)能力。與BCS和BMS支架相比，DS支架在第8、12和24周的軟骨修復(fù)表現(xiàn)出更好的總體外觀。在移植后的24周期間，對膝關(guān)節(jié)手術(shù)進(jìn)行了磁共振成像，這表明DS組在24周后軟骨下水腫的分辨率和關(guān)節(jié)表面的愈合明顯更好。
此外，與NG組相比，梯度支架組在體內(nèi)24周內(nèi)顯示出更好的軟骨保護(hù)作用，組織學(xué)評分明顯更高，在24周內(nèi)具有更好的修復(fù)效果。DS各向異性支架比BCS或BMS組具有更好的軟骨修復(fù)效果，并且移植后保持較好的關(guān)節(jié)功能。
雙因子釋放和梯度結(jié)構(gòu)支架恢復(fù)了天然軟骨的各向異性和更好的微血管向內(nèi)生長
隨著天然關(guān)節(jié)軟骨從淺表層區(qū)域向深層區(qū)域的轉(zhuǎn)變，不同表型的軟骨細(xì)胞呈現(xiàn)出較高的潤滑性和淺表層的GAG（PRG4，ACAN表達(dá)）以及深層的骨化（RUNX2，COL10A1表達(dá)）。
在本研究中，我們進(jìn)一步測試了所生成軟骨的各向異性，并將其與天然軟骨進(jìn)行了比較。在表層，免疫染色顯示與其他兩組相比，DS組和天然軟骨中PRG4和ACAN的表達(dá)更高（圖6，A至C）。
同時，植入雙因子釋放和梯度結(jié)構(gòu)支架的組也觀察到了骨化標(biāo)記物（RUNX2和COL10A1）的較高表達(dá)（圖6，D至F）。這些結(jié)果表明，雙因子釋放和梯度結(jié)構(gòu)支架可以更好地恢復(fù)天然軟骨在特定層中具有不同的成軟骨和骨化標(biāo)記物的各向異性。
此外，DS支架類似于天然軟骨深層的向內(nèi)生長的微血管，與孔徑較小的組相比，DS支架可以更好地促進(jìn)微血管向內(nèi)生長，這表明在深部區(qū)域，孔徑較大的組織具有更好的營養(yǎng)供應(yīng)和組織整合。
展望
總之，研究人員設(shè)計了具有結(jié)構(gòu)完整性的3D生物打印各向異性構(gòu)造，用于關(guān)節(jié)重建和關(guān)節(jié)軟骨再生，并進(jìn)一步在兔軟骨缺損模型中測試了功能性膝關(guān)節(jié)軟骨構(gòu)造。
通過順序印刷帶有梯度結(jié)構(gòu)的合成PCL聚合物的蛋白釋放蛋白和MSC載水凝膠，可以創(chuàng)建具有所需結(jié)構(gòu)完整性并準(zhǔn)備用于外科手術(shù)植入的人規(guī)模軟骨構(gòu)建體，該技術(shù)也可以用于再生軟骨整個關(guān)節(jié)。與PCL支架相結(jié)合的打印為水凝膠提供了均勻性，并為體內(nèi)研究提供了所需的機(jī)械性能。在本研究中，充滿細(xì)胞的水凝膠可以使MSC和蛋白質(zhì)包裹的微球分布均勻，從而保護(hù)細(xì)胞活力并促進(jìn)其在支架中的分化和擴(kuò)增。
同時，相鄰的PCL腳手架提供了足夠的機(jī)械支撐和結(jié)構(gòu)完整性，為水凝膠中的3D錨定MSC細(xì)胞提供了穩(wěn)定的微環(huán)境，以分化并形成組織，其分泌的軟骨基質(zhì)隨著水凝膠的緩慢降解而替代了水凝膠。
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