近年來,由疾病、外部創(chuàng)傷等原因引起的骨缺損一直是研究熱點和產業(yè)熱點。上市的產品不勝枚舉,在功能上也是各有千秋。所以想在如此成熟的領域再有所斬獲,推陳出新,甚至將其發(fā)表在《Nature?Materials》,難度可見一斑。

骨缺損處需要大量的填充物。根據(jù)經典的組織工程三要素理論設計的填充支架存在一個重大挑戰(zhàn)就是種子細胞植入體內后存活率低,這嚴重影響了其修復再生的能力。那能不能給細胞打打雞血?安心骨修復呢?

倫敦國王學院干細胞和再生醫(yī)學中心的研究團隊近日報道了一種新型骨修復繃帶,以生物可降解的聚己內酯(PCL)作為繃帶基材,通過調控Wnt信號通路,實現(xiàn)人骨骼干細胞(hSSCs)長期(>8周)存活能力。在大鼠顱骨缺損模型中,經修復后的新形成的骨在結構上可與成熟的皮質骨相媲美,并由人(人的細胞由修復繃帶負載植入的)和鼠細胞組成。該研究精巧地在修復繃帶上設計了一種包含三維Wnt誘導成骨組織模型(WIOTM),介導人骨骼干細胞不對稱分裂,同時產生Wnt-近端骨骼肌干細胞和易于分化的Wnt-遠端細胞,促進骨修復。

Wnt3a誘導細胞不對稱分裂,成骨基因差異化表達

根據(jù)作者前期研究,發(fā)現(xiàn)在Wnt3a蛋白的刺激下,大約53%的骨骼肌干細胞激活了Wnt?/β連環(huán)蛋白通路(Wnt/β-Catenin通路調節(jié)干細胞的多能性,并且在發(fā)育過程中決定細胞的分化命運)。有意思的是,與固定化的Wnt3a不同,在可溶性的培養(yǎng)基中加入Wnt3a蛋白可誘導hSSC增殖,但是不促進細胞遷移。研究人員進而探究,細胞的分裂方向與多層形成是否由Wnt3a在hSSCs一側的不對稱呈現(xiàn)耦合和調控的(圖2b,Wnt3a表面上可能的細胞分裂模式的三維圖示)。研究人員在Wnt3a平臺上低密度培養(yǎng)hSSCs,并在成骨培養(yǎng)基中加入COL1-gel,利用三維成像顯示了hSSCs中期有絲分裂的方向,發(fā)現(xiàn)存在兩類分裂方式的細胞。其一,垂直于Wnt3a平臺且在花狀染色質環(huán)的中期排列染色體的細胞(圖1 d, e);其二,平行于Wnt3a平臺分裂的細胞,其染色質環(huán)立在邊緣,從上面看是一個長方形。與此同時,與未被激活Wnt/β-Catenin通路的細胞相比,作者觀察到垂直于Wnt3a平臺分裂的細胞比例顯著增加(圖1c)。除了分裂方式不同,在垂直于Wnt3a -平臺的分裂中,作者發(fā)現(xiàn)腺瘤性結腸息肉病蛋白APC、極性蛋白非典型激酶Cζ(紡錘體定向通常需要將極性蛋白不典型蛋白激酶Cζ(aPKCζ)劃分到細胞的一側)和連環(huán)蛋白catenin主要定位于Wnt3a -近端細胞(圖1d-g,l)。在平行分裂中,這些蛋白在細胞的兩半中分布相似 (圖. 1d,g,l)。

在相關基因表達上,最近發(fā)現(xiàn)的hSSC標記物CDH13和PLXNA2在Wnt3a -近端細胞中高表達,在遠離Wnt3a -平臺的細胞中下調(圖2 a,b,c)。然而成骨基因OCN和OPN在Wnt3a -遠端細胞中高表達(圖2 d,f)。在平行于wnt3a平臺分裂的細胞中,分裂的細胞對之間的干細胞和分化標志物分布是一致的(圖2e,f,i–k)。

因此作者認為,在以Wnt3a介導的單個hSSCs分裂過程中,定位的Wnt3a誘導Wnt3a近端-細胞中干細胞命運標記物的富集,誘導Wnt3a-遠端細胞的早期成骨分化標志物富集。

?老掉牙的改性PCL骨修復發(fā)《自然·材料》,有這么簡單?

圖1所示。定位的Wnt3a誘導骨骼干細胞不對稱分裂。

?老掉牙的改性PCL骨修復發(fā)《自然·材料》,有這么簡單?

圖2所示。定位的Wnt3a誘導細胞命運標記物在分裂細胞中不對稱分布。

生物降解Wnt3a繃帶的制作,驗證骨修復能力

為了將誘導成骨模型(WIOTM,Wnt3a誘導骨骼干細胞所形成的成骨模型)移植到體內,研究人員設計了一種結合Wnt3a蛋白生物相容性繃帶,用于移植移植細胞。他們使用臨床認可的聚己內酯(PCL)聚合物薄膜,經過氧等離子體處理表面,然后用氨基丙基-三乙氧基硅烷(APTES)孵育)。?(O2/APTES)為Wnt3a共軛提供了伯胺官能團。重要的是,支架上的伯胺官能團在室溫下可保持8周穩(wěn)定性。純化的Wnt3a蛋白通過戊二醛共價結合到胺基上。

研究人員制備出骨修復繃帶后,首先用western blot分析驗證了Wnt3a成功地共價結合到了PCL繃帶上(圖3 a)。同時為了驗證結合后的Wnt3a活性,作者又進行了TCF-熒光素酶報告細胞系(LS/L)測定(TCF是β-catenin通路激活的一個標志性效應因子),顯示共價結合后的Wnt3a保持了極高的激活β連環(huán)蛋白途徑的能力(圖3 b)。為了驗證hSSCs的活性,作者將具有7xTCF-eGFP//SV40-mCherry基因的hSSCs種植在了Wnt3a繃帶上,結果顯示,接枝了20或60 ng Wnt3a的Wnt3a-PCL的hSSCs顯示eGFP表達的增強呈劑量依賴性,而iWnt3a-PCL和牛血清白蛋白-PCL (BSA-PCL)對照顯示eGFP的基礎水平表達(圖3c,d)。eGFP表達受7xTCF結合位點控制,mCherry顯示紅色熒光,在細胞中是組成性共表達。

?老掉牙的改性PCL骨修復發(fā)《自然·材料》,有這么簡單?

圖3。Wnt3a -繃帶的體外功能研究

研究人員以大鼠顱骨缺損為模型,驗證繃帶的體內修復的效果。植入修復八周后,微型計算機斷層掃描(μCT)分析結果顯示,由Wnt3a繃帶覆蓋的缺損部位表現(xiàn)出明顯的新骨形成,而WIOTM繃帶組表現(xiàn)出更多的骨形成,為Wnt3a繃帶組的近兩倍(圖 4c,d)。組織學染色評價表明,WIOTM繃帶組的缺損部位新形成的骨礦化區(qū)域顯示了健康骨的組織學特征,其中核被拉長且稀疏分布,此外,周圍的鈣化組織呈現(xiàn)條紋,這是板層骨的特征(圖4e,f)。連接缺損的結締組織/間質樣組織顯示出密集的細胞核(圖4e)。在Wnt3a和WIOTM繃帶組處理的缺損中,缺損部位中段和缺損邊緣均有新骨形成,表明在修復和再生過程中,新骨與已有骨融合(圖4e)。新形成的骨內血管也被檢測到(圖4f)。

?老掉牙的改性PCL骨修復發(fā)《自然·材料》,有這么簡單?

圖4。Wnt3a和WIOTM繃帶在修復骨缺損中的體內功能評價。

小結

最后,研究者得出結論,接枝了Wnt3a的修復繃帶打破了細胞分裂過程的對稱性,使hSSCs分裂形成富集早期成骨分化基因的Wnt3a -遠端細胞和富集了連環(huán)蛋白、APC、細胞極性蛋白aPKC和干細胞標記物的Wnt3a -近端細胞。該種設計,即WIOTM繃帶,能同時維持損傷部位的人的hSSCs和成骨細胞,加速骨修復。植入體內后顯示出了極佳的骨修復效果。

該研究成果以題為“Wnt-modified materials mediate asymmetric stem cell division to direct human osteogenic tissue formation for bone repair”的論文發(fā)表在《Nature Materials》上(見文后原文鏈接)。文章第一作者為Yoshihisa Okuchi,通訊作者為倫敦國王學院干細胞和再生醫(yī)學中心的 Shukry J. Habib教授。

全文鏈接:

https://www.nature.com/articles/s41563-020-0786-5#Sec32

微信
微信
電話 QQ
返回頂部